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液相色谱填料研究进展

 

一、        概述

色谱固定相一直被人们称为色谱的“心脏”,在色谱分离中扮演着不可或缺的角色,色谱填料的发展情况密切关系着色谱技术的发展。

常用的色谱填料类型按基质不同可分为三类:无机基质、有机基质和有机-无机复合基质填料。无机基质填料机械强度高,在任何介质中均呈现不可压缩性,且色谱柱柱效高,是色谱填料研究和应用的主流。硅胶以其柱效高、机械强度高,物理性质如粒径分布、孔结构、比表面积易于控制,表面易改性等优点,是最主要的固定相基质。早期经典液相色谱填料通常是30-40µm、40-60µm或更大粒径的不定形硅胶,这些硅胶由更大粒径的硅胶研磨,再经过粒径分级得到,柱效仅为1000/m;20世纪70年代后期,5-10µm不定形硅胶填料应用于液相色谱,柱效达到25000/m;年代至今,80年代至今,在分析型色谱柱领域,5-10µm球形硅胶填料逐渐取代无定形硅胶填料,柱效可达50000-80000/m;90年代初,亚2µm硅胶填料用于高效液相色谱的快速分离成为一种新的发展趋势。

有机基质材料主要为有机聚合物和石墨碳,此类材料克服了硅胶基质填料不耐强酸强碱的缺点,化学稳定性好,pH值适用范围宽,疏水保留性很强,近年来获得飞速的发展。与相同粒度硅胶基质色谱柱相比,其主要缺点是柱效低,且在不同有机改性剂中溶胀程度不同,只能应用于单一有机改性剂的等度分离。有机-无机复合材料结合了无机材料的高效性、优良的机械强度以及有机材料的耐热性、pH值使用范围宽等特点,日益受到人们的重视。

多糖、蛋白、多肽等大分子化合物的分离纯化是目前研究的热点,分离困难,几乎不太可能用单一方法纯化。参考最近三年文献,分离大多使用色谱法,使用中压分离的比例极小。但目前分离填料越做越细,采用中高压层析应是趋势。从手头已有资料来看,用于多糖、蛋白、多肽制备分离填料粒径与反相硅胶相似,但由于其规定流速小于反相硅胶,所以同等内径和长度的色谱柱流速和压力均低于反相硅胶。蛋白质、多肽有多种分离方法,其中最常见的是反相色谱(RPC)、离子交换色谱(IEC)、体积排阻色谱(SEC)、疏水色谱(HIC)、亲合色谱(AFC),根据蛋白质分子的大小形状、特殊结构、电荷、疏水性等特征选用一种或几种方法进行纯化。

目前,商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售,填料的粒度主要影响填充柱的两个参数,即柱效和背压。粒度越小,填充柱的柱效越高;小于3um的填料应用,在相同选择性条件下,提高柱效可提高分离度,但不是 的因素。如果固定相选择是正确,但是分离度不够,那么选择更小粒度的填料是很有用的,3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%;然而,3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时,柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱,以缩短分析时间,另外,可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度,比如用乙腈代替甲醇,以降低色谱柱的压力。

一般来说,分析型色谱柱填料也可以用于制备型色谱柱中,但是制备色谱中使用的量大,而且需要反复装柱,因此对于制备色谱填料有一些特殊的要求:(1)机械强度高;(2)负载量高,单位重量的填料负载量高可以处理更多的样品;(3)可大量供应,批间的重现性好;(4)粒径大小合适,分布范围窄;(5)化学稳定性好,选择性好,无毒,易于填充,价格合理等。

制备柱是否装填均匀、结实,关系到色谱过程的分离效率,是柱技术中最关键的部分, 也是决定柱效高低的主要因素之一。目前,制备柱的装柱方法主要有干装法、匀浆法和压缩法三种。干装法是色谱柱在做上下抖动的同时,将柱填料加入柱子中。干装法填装的柱子柱床相对稳定,均匀,填充装置简单,成本低。此法适合于装填颗粒度大于20~30μm的填料,而颗粒小于20μm的填料不宜用此法装填,不易于填装均匀。匀浆法又称湿法,是用等密度溶剂作为匀浆剂,经超声波处理,使填料在匀浆剂中高度分散制成匀浆,在高压下,用顶替液将匀浆压入柱内,制成具有均匀、紧密填充床的制备色谱柱。匀浆法现已成功用于柱径不超过100mm的制备柱的装填,而大柱径制备柱的装填不适合用此法,因为柱径大,难以得到稳定的柱床。压缩法主要有轴向压缩法、径向压缩法和环形膨胀压缩法,前两种使用前述的相应设备即可实现。环形膨胀柱是通过柱中心的一个楔形杆推动活塞上下移动,产生挤压柱床的径向和轴向复合力,使柱填充紧密,目前还处于试验阶段。

二、        填料种类

如今填料种类繁多,常见的有硅胶填料、手性填料、离子交换色谱填料、聚合物填料和其他无机填料等。

1. 硅胶填料

硅胶填料主要应用正相色谱及反相色谱柱中,正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica),以及其他具有极性官能团,如胺基团(NH2、APS)和氰基团(CN、CPS)的键合相填料。

由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他团的极性较强,因此,分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小,即极性强的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低,如:正乙烷(Hexane),氯仿(Chloroform),二氯甲烷(Methylene  Chloride)等。

反相色谱填料常是以硅胶为基础,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强,通常为水,缓冲液与甲醇,已腈等混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出,而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(Phenyl)等。

目前在制备色谱中,使用最多的就是硅胶及其衍生物的键合固定相(如C18 ) 填料。虽然硅胶及其衍生物使用的较多,但是它们也有其缺点,例如硅胶对极性物质(特别是对碱性溶质)产生非特异性吸附,导致峰严重拖尾。为了克服上述缺点,人们对高纯硅胶及其键合固定相进行了潜心的开发,得到了金属杂质含量极低的高纯硅胶及其键合固定相。

超纯硅胶微球的制备一般以正硅酸乙酯(TEOS)为硅源,采用喷雾干燥法、聚合诱导胶体聚集法(PICA)、一次催化溶胶-凝胶法、二次催化溶胶-凝胶法、模板法等方法制备。喷雾干燥法是在不融合的两相条件下使硅酸盐聚合生成溶胶,再将硅溶胶喷雾成形变为凝胶,然后在热气流或石蜡油等分散剂中固化得到最终的硅胶微球产品,这是目前催化剂等化工产品用硅胶的最主要制备方法之一。目前市场上平均孔径在6-12nm,比表面积在300-500m2/g范围的多孔硅胶 微球,如国产的YQG型、瑞典的Kromasil、德国的Nuclesil等均采用该方法制备。聚合诱导胶体聚集法又称堆积硅珠法,是通过在硅溶胶分散体系中的聚合反应,将纳米级硅溶胶包结成有机-无机复合微球,烧结除去有机物后得到全多孔硅胶微球,以该法生产的典型代表是美国Agilent公司生产的Zorbax硅胶。溶胶-凝胶法是制备硅胶微球的常用方法,通常在酸性或碱性条件下使硅源水解缩聚得到硅胶微球。模板法是在传统溶胶凝胶体系中引入模板物质,在溶剂存在的条件下使模板剂对硅源进行引导,从而生成具有纳米有序结构的介孔性硅胶。硅胶经表面改性可制得适用于不同分离模式的色谱填料,这种改性与修饰一般通过三种方法实现:表面的化学修饰、整体修饰和聚合物包覆。

2. 手性填料

物质与其镜像不能叠合的现象被称为手性(Chirality)。互为对映体的两分子,仅在原子空间排列方式上存在着微小差异,除旋光性不同之外,其他理化性质二者完全相同,常常以外消旋体形式存在。这些手性异构体的存在是人类赖以生存的自然界的一种普遍现象,组成生命体系的大分子如蛋白质、核酸、多糖等都具有手性特征,它们影响着食品、药品以及各种添加剂等手性物质在体内的运输和代谢方式。

手性异构体的存在,在药物化学领域显得尤为突出。据权威统计,世界上心脑血管等重大疾病的治疗药物均属高科技含量的合成药,这些药物结构中大多含有不对称的碳原子,均属于手性药物范畴,在市场及临床方面多以外消旋体的形式销售和使用。药物对映体通常具有不同的毒性作用、药理功能和药代动力学行为。因此,不当使用外消旋体药物,可能导致错误的药代动力学行为和作用模式,进而产生严重的影响。手性药物以其作用靶点明确,见效快,成为了全世界治疗重大疾病的疗效药物,是药物界的一颗摧壤明星,故而也成为了科研人员研发的焦点。但由于发展太快,多数手性药物还未建立系统有效的分析方法。建立和发展高效、快速、准确的药物对映体分析方法对药物的开发和临床用药指导具有重要意义。

手性填料的研发成为手性分离的重中之重。手性色谱柱是由具有光学活性的单体,固定在娃胶或其它聚合物上制成手性固定相。通过手性环境的引入使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别,手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用,即为“三点作用原理”。该原理认为:在手性分离中,要实现溶质化合物的有效拆分,溶质和固定相之间至少存在三点相互作用。这些作用可以是氧键作用、静电作用、偶极-偶极作用、Л-Л作用、疏水作用或空间作用等,并且至少其中一点要有立体选择性,即当用手性物质中的另一对映体来替代后,至少有一种作用力消失在或明显改变性质。

目前国际上已经研制出约有1500多种手性填料,其中有200多种已商品化。为了简单化,根据一种被广泛采用的Wainer分类方法即基于CSP与被分析物之间相互作用机理不同分为Pirkle型手性填料、环糊精类手性填料、大环抗生素类手性填料、蛋白质类手性填料、配体交换型手性填料和纤维素类手性填料。

3. 离子交换色谱填料

离子交换色谱是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的待分离组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而将混合物进行分离的一种色谱方法。

离子交换色谱填料是由载体、配基 (离子官能团) 和反离子3部分组成。载体是惰性物质,在离子交换过程中不参与任何反应。配基结合在载体上,反离子通过静电引力与配基相结合。如果配基是带正电的基团,反离子就是带负电,这种类型称为阴离子交换剂,可以吸附带负电的蛋白质。如果配基是带负电的基团,那么反离子就是带正电,称为阳离子交换剂,可以吸附带正电荷的蛋白质。

4. 聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸酯等,其主要优点是在PH值为1~14均可使用。相对与硅胶基质的C18填料,这类填料具有更强的疏水性;大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料,色谱柱柱效较低。

5. 其他无机填料

由于其特殊的性质,一般仅限于特殊的用途。如石墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相,石墨化碳的表面即是保留的基础,不再需其它的表面改性,该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强,石墨化碳可用于分离某些几何导构体,又由于在液相色谱流动相中不会被溶解,这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于液相色谱,氧化铝微粒刚性强,可制成稳定的色谱柱柱床,其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强,应用范围受到一定的限制,所以未能广泛应用,新型氧化锆填料也可用于液相色谱,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱,应用PH范围1~14,温度可达100℃。由于氧化锆填料几年才开始研究,加之面临的实验难度,其重要用途与优势尚在进行中。

三、        色谱填料发展方向

  一是研发小粒径的色谱填料和发展整体柱,朝着快速、高效分离的方向发展。超高效液相色谱比高效液相色谱分析速度更快更灵敏,它通过性能优越的色谱柱,精确梯度控制的超高压液相色谱泵,低扩散、低交叉污染的自动进样系统及高速检测器使超高效液相色谱的峰容量、分析效率、灵敏度较常规高效液相色谱有了很大的提高,为复杂体系的分离分析提供了良好的条件。

  二是应用杂化材料和具有高分离度的填料解决色谱柱分析分离中目前存在的一些问题,比如说一些极性很强的化合物的保留和分离的问题。

三是发展多维色谱的出现,二维液相色谱是近年来发展起来的一种高效分离技术,正交的二维系统在分辨率、峰容量方面比一维情况都有所增加,已成为复杂体系组分分离和分析的强有力工具,在生命科学研究中得到了广泛的应用。但目前液相色谱的二维分析系统还有很多问题仍未解决,比如说二维体系分离中的正交性分离的问题。

近年来人们制备了大量的含有不同键合基团的色谱填料以增强色谱柱的选择性,从而满足实际样品分离的需要,例如亲水作用色谱(HILIC)填料、立体保护键合色谱填料、极性嵌入反相色谱填料、有机-无机杂化色谱填料、亲水性体积排阻色谱填料、混合模式色谱填料、手性色谱填料以及聚合物基质色谱柱填料。

四、        填料厂家

近年来,为了适应科学的进步和工业技术的发展,制备色谱技术也取得了显著进步,成为许多公司进行商业竞争的热点。生产和供应制备色谱填料的厂家和公司很多,类型和规格也在不断发展,主要厂家见附表。工业制备分离色谱柱一般为动态轴向压缩柱(DAC)柱,目前生产DAC柱的厂商主要有法国的NovaSep(由以前的Prochrom和Novasep合并)、美国的MODcol、英国的Jones Chromatography和德国的Merck KGaA等公司。

附表:制备色谱填料厂家一览表

生产厂家

填料类型

规格型号

YMC

杂化硅胶填料(YMC-Triart Prep)

硅胶类填料(YMC-Exphere C18;YMC*GEL HG;YMC*GEL;制备用不定型填料)

生物液相中试类填料(YMC-BioPro离子交换填料)

 

粒径:10, 15, 20µm

PH值范围:2~10

 

富士

Chromatorex产品系列:SPS SMBMB GS

 

粒径:3,5,10,15,20和20 - 45µm

      曹(DAISO

C18(ODS)C8C4APS(氨基)、苯基、氰基、二醇

孔径:60Å、100Å、120Å和200Å、300Å

     克(Merck

正相硅胶(Silica Gel 40;Silica Gel 60;Silica Gel 100)

反相C18硅胶(Silica Gel60)

 

粒径:63-200μm;40-63μm

 

阿克苏诺贝尔(Kromasil

SILC4C8C18NH2        Phenyl

 

粒径:7μm;10μm;13μm;16μm

 

赛分科技

硅胶基质填料(球形硅胶基质填料;不定形硅胶基质填料)

聚合物基质填料(Generik MC离子交换填料;PolyRP反相层析填料;Generik 离子交换填料;Proteomix 离子交换填料;MabPurix™亲和填料;Agarosix FF离子交换填料)

粒径:5μm;10μm;15μm;20μm;20-40μm;40-60μm;

迪马

Inspire(SIL;C4;C8;C18;C18-EP;Diol)

粒径:10μm

 

疏水色谱填料(Hexyl;Butyl)

反相色谱填料(200Å填料;300Å填料)

粒径:5μm;10μm;15μm;20μm;40μm;50μm

苏州纳微生物科技

单分散聚合物色谱填料

硅胶色谱填料

反相聚合物色谱填料

离子交换色谱填料

疏水色谱填料

亲和层析填料

凝胶渗透色谱

万古霉素专用色谱填料

富勒烯专用色谱填料

甜菊糖专用色谱填料

固相萃取填料

粒径:5μm;10μm;15μm;20μm;30μm;40μm;50μm

济南博纳生物技术有限公司

硅胶色谱填料( 正相色谱填料;反相硅胶填料)

聚合物色谱填料

固相萃取填料

琼脂糖凝胶填料

粒径:5μm;10μm;15μm;20μm;30μm;40μm;50μm

月旭

Ultimate®色谱填料

XtimateTM色谱填料

Welchrom®色谱填料

孔径:120 Å、200Å、300Å

博纳艾杰尔

正相色谱填料

C4C8C18 等反相键合填料

HILIC亲水键合填料

氧化铝(中性/酸性/碱性)

离子交换树脂

 

格雷斯(Grace

Vydac 150HC多肽填料

 

研创手性

手性填料(SDMP;MDMP;MCDP;SCDP;IC;IB;IA;AS;AD;OA;OD;OJ

粒径:10μm;20μm

常州嘉众新材料科技有限公司

Outstanding 卓越系列

Cleaning-P 树脂基系列填料

 

粒径:30μm;60μm

孔径:60~300 Å

苏州知益微球科技有限公司

聚合物反相色谱填料

凝胶渗透色谱

 

粒径:15μm;20μm;25μm;;30μm

 

 

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